بنابراین پس از جداسازی و تكثیر ژنهای فوق مراحل زیر در این تحقیق انجام گرفت.
1- لكون نمودن ژنهای فوق در یك ناقل انتقال دهنده Cleaning vector 2- تعیین ترادف نوكلئوتیدی ژنهای جداشده و مقایسه آن با ژنهای L7/L12 3- كلون نمودن ژنها در پلاسمید بیان كننده پروكاریونی Procaryotic expression vector 4- تولید و تخلیص پروتئینهای L7/L12 و P39 5- كلون نمودن آنها در پلاسمید بیان كننده اوكاریوتی Eucaryotic expression vector 6- هاری كردن پلاسمیدهای فوق از آندوتوكسین 7- تزریق پلاسمیدها، بسویه واكنش و سویه بیماریزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C 8- سنجشهای ایمونولوژیك باكتریها و پلاسمیدهایی كه برای انجام این پایان نامه استفاده دشه اند بترتیب زیر می باشند: باكتریها: بروسلاآبورتوس سویه های 19S و 544 اشدیشیالكی سویه اشریشیالكی سویه BL21 – اشریشیاكی سویه BL21(DE3(Plyss پلاسمیرها: PGEX4T1 – PRT 28a – SK+(pSK) - Pblue Script-PCDNA3 جداسازی كروموزوم بروسلا آبورتوس 19S: برای تكثیر ج داسازی ژنهای L7/L12 و P39 ابتدا كروموزوم باكتری جداسازی گردید.
مواد: بافر TE: Tris – Hel 10mm EDTA 1.
0mm PH بافر را پس از تهیه برروی 8 تنظیم می نمائیم.
پروتئیناز K: CTAB/NaCl: Nacl 4.
1gr CTAB 10gr DDW 100ml (Final Volume) روش: ابتدا محیط برنسط برات را تهیه و استریل نموده و ml5 از محیط را با بروسط آبورتوس سویه 19S تلقیح می نمائیم.
پس 48 تا 72 ساعت باكتریها رشد كرده و كدورت مناسبی را پیدا می كند.
بقیه مراحل تخلیص كروموزوم بشرح زیر است: 1- 5/1 میلی لیتر از سوسپاستیون فوق را مدت 2 دقیقه در rpm5000 سانتریفوژ می نمائیم.
محلول رویی را دور می ریزیم.
2- Ml576 از بافر TE را بر روی رسوب باكتری اضافه كرده و رسوب را در بافر حل می نمائیم.
سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئیناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت یكساعت در دمای 0C37 نگهداری می نمائیم.
3- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بمیزان Ml80 اضافه كرده و بمدت 10 دققیق در 0C65 انكوبه می كنیم.
4- هم حجم مخلوط بالا از تركیب كلروفرم – ایزوآمیل (1/24) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در rpm10000 سانترفوژ می كنیم.
محلول رویی را به لوله دیگر منتقل می نمائیم.
5- هم حجم محلول روئی ترمیب فنل – كلروفرم – ایزوآمیل (1/24/25) پس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در vpr10000 سانتریفوژ كرده و محلول رویی به لوله دیگری منتقل می نمائیم.
6- هم حجم محلول روئی ایزوپروپانل اضافه نموده و مخلوط می كنیم.
پس از چند دقیقه DNA كروموزومی ته نشین شده كه می توان بات یك پیپت پاستور آنرا جمع آوری نمائیم.
7- رسوب DNA كروموزومی را با الكل 70% شستشو داده و پس از خشك شدن در مجاورت هوا در Ml100 از بافر TE حل می نمائیم.
بررسی كمی و كیفی DNA كروموزومی: برای تعیین خلوط كروموزوم باكتری از مواد و وسایل زیر استفاده میشود....